Иммунотерапия рака: CCR4 – потенциальный маркер для
селективной деплеции FOXP3+ CD4+ регуляторных Т-клеток эффекторного типа

Daisuke Sugiyama and Hiroyoshi Nishikawa

Department of Immunology, Nagoya University Graduate School of Medicine, Nagoya, Japan

Введение

Регуляторные Т-клетки (CD4+CD25+), экспрессирующие транскрипционный фактор FOXP3, играют важную роль в супрессии противоопухолевого иммунного ответа. В ряде клинических исследований, выявлен позитивный эффект деплеции CD25+-лимфоцитов, заключающийся в усилении противоопухолевого ответа.[1,2].Однако другие подобные исследования не подтверждают данный положительный результат [3,4,5]. Применение процедуры деплеции CD25+ лимфоцитов в рамках противоопухолевой терапии является темой для дискуссии, т.к. активированные эффекторные Т-клетки также экспрессируют молекулу CD25 и обеспечивают экспансию CD8+ цитотоксических  Т-лимфоцитов. Истощение пула CD8+ CD25+ Т-лимфоцитов может полностью нивелировать позитивный эффект деплеции CD25+ регуляторных Т-клеток и подавить развитие противоопухолевого иммунного ответа [3]. Более того, результаты, полученные на моделях животных показывают возможность развития аутоиммунных реакций в ответ на деплецию Т-регуляторных клеток [6,7,8]. Поэтому в настоящее время, основная задача исследований состоит в определении более конкретных маркеров для контроля иммуносупрессивного потенциала Т-регуляторных клеток без воздействия на функционирование эффекторных Т-клеток и активацию аутоиммунных процессов.

Т-клетки инфильтрата опухоли, по сравнению с Т-клетками периферической  крови, содержат большое количество эффекторных регуляторных Т-клеток (eTreg), которые можно идентифицировать как  FOXP3 hi and CD45RA- Т-клетки. Они являются терминально дифференцированными и обладают высоким супрессорным потенциалом. eTreg, в отличие от  FOXP3 lo and CD45RA+ наивных регуляторных Т-клеток преимущественно экспрессируют рецептор CCR4 как в опухолевой ткани меланомы, так и в периферической крови. In vivo и In vitro терапия anti-CCR4 моноклональными антителами позволяет селективно деплецировать eTreg и эффективно индуцировать специфический CD4+ и CD8+ Т-клеточный иммунный ответ [9].

Данная статья является примером использования диссоциатора тканей  gentleMACS™ Dissociator и клеточного сепаратора autoMACS® Pro Separator для автоматизации экспериментального процесса, обеспечения воспроизводимых результатов в процессе пробоподготовки и клеточной сепарации.

Материалы и Методы

С материалами и методами можно ознакомиться в оригинальной версии статьи, перейдя по ссылке: https://www.miltenyibiotec.com/_Resources/Persistent/15d90fd1f5aa7d860fb1e00df9317bfcd72fbb95/IM0020949.pdf

Результаты:

Деплеция CCR4+ клеток позволяет селективно удалять eTreg из пула PBMC

Высокая экспрессия рецептора CCR4 у пациентов с меланомой обнаруживалась преимущественно на популяции eTreg и практически не обнаруживалась на популяции наивных Т-регуляторных клеток (nTreg). Схожая тенденция наблюдалась и в пуле PBMC здоровых доноров [9]. Деплеция CCR4 клеток приводила к значительному уменьшению количества eTreg, тогда как количество nTreg оставалось практически неизменным. Напротив, в процессе деплеции CD25+ клеток, значительно снижалось количество как eTreg, так и nTreg.

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 1: In vitro деплеция CCR4+ клеток эффективно снижает количество эффекторных Treg клеток. Анализ, методом проточной цитометрии, экспрессии FOXP3,  D45RA, и CCR4 на CD4+ T клетках PBMCs, полученных от пациентов с  меланомой (A). Цифры на дот плотах показывают процент клеток каждой фракции от CD4+ T -клеток. Различные фракции обозначены как nTreg клетки (I), eTreg клетки (II), FOXP3lo не-Treg клетки (III), памяти и активированные Th (IV), и наивные Th клетки (V). Экспрессия CCR4 и CD25 на фракции I и II показана на гистограмме (A; нижняя панель). CCR4+ клетки (B) или CD25+ клетки (C) деплецированы из PBMCs с помощью сепаратора autoMACS Pro Separator, и далее  CCR4– и CD25– клетки были проанализированы по экспрессии FOXP3 и CD45RA (B, C; верхняя панель). Процент nTreg клеток (фракция I) и eTreg клеток (фракция II) в PBMCs до деплеции и после CCR4+ (B) или CD25+ (C) клеточной деплеции показаны для 6 доноров.

 

Ткань меланомы преимущественно инфильтрирована CCR4+ eTreg клетками, которые могут быть успешно деплецированы

Известно, что FOXP3+ Т-клетки проникают в опухоль локально, однако их детальный фенотип до сих пор четко не определен. Опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TILs) из ткани меланомы выделены с использованием диссоциатора тканей gentleMACS Dissociator. Цитометрический  анализ инфильтрата был проведен таким же образом, как показано на рис.1.А. В инфильтрате опухоли обнаружен большой процент eTreg клеток (рис. 2.А.), по сравнению с PBMC, что говорит о том, что частота встречаемости эффекторных Т-регуляторных клеток в тканях опухоли меланомы выше, чем в пуле PBMC. С применением метода селективной деплеции CCR4+ клеток удалось существенно снизить количество eTreg, инфильтрирующих опухолевую ткань (рис. 2.В.).

 

 

Рис. 2:Ткань меланомы преимущественно инфильтрирована CCR4+ eTreg клетками (A) Опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TILs) из ткани меланомы выделены с использованием диссоциатора тканей gentleMACS Dissociator и проанализированы методом проточной цитометрии. (B) После деплеции CCR4+ клеток, с применением сепаратора autoMACS Pro Separator, была проанализирована частота встречаемости FOXP3hi eTreg клеток. Цифры показывают процент FOXP3 hi CCR4+ клеток среди  CD4+ T клеток.

 

Заключение

Скрининг новых маркеров-кандидатов для эффективный  иммунотерапии рака является сложной и трудоемкой задачей. Сочетанное использование диссоциатора тканей gentleMACS Dissociator и клеточного сепаратора autoMACS Pro Separator позволило автоматизировать рабочий процесс и использовать CCR4 в качестве селективного маркера для удаления eTreg клеток– наиболее иммуносупрессорной популяции Treg. Деплеция eTreg клеток по маркеру CCR4 не оказала влияния на другие субпопуляции Тreg клеток, в отличие от деплеции по маркеру CD25 которая приводила к удалению различных субпопуляций регуляторных Т-клеток.