Экзосомы были обнаружены почти 30 лет назад, однако, только недавно исследователи по всему миру стали уделять им особое внимание. В настоящее время ученые изучают состав экзосом, исследуют их функции и возможную взаимосвязь с онкологическими и другими заболеваниями. Изучаются разнообразные функциональные изменения, возникающие в клетках при поглощении экзосом, происходящем путем слияния мембран или лиганд-рецепторного взаимодействия.

Ранее считалось, что экзосомы — это не более чем системы утилизации «клеточного мусора», однако сейчас стремительно накапливаются доказательства  о роли экзосом в качестве «мессенджеров», передающих информацию между клетками. Экзосомы представляют собой  маленькие мембранные везикулы, переносящие белки, липиды, микроРНК и мРНК. Они специфичны для типа клеток, из которых они происходят, например для Т-клеток, В-лимфоцитов, дендритных клеток, тромбоцитов, нейронов, или эпителиальных клеток. Экзосомы транспортируют различные молекулы к удаленным тканям организма посредством перемещения в биологических жидкостях.

Благодаря их небольшому размеру (≤150 nm), выделение, очистка и изучение экзосом является достаточно трудной задачей. С помощью метода проточной цитометрии практически невозможно обнаружить и исследовать одиночные экзосомы, однако возможно получить представление о популяции экзосом, происходящей от определенного типа клеток. Для этого можно окрасить белки на поверхности экзосом, используя специфические флуорохром-конъюгированные антитела.

Протокол исследования

Для проведения исследований необходимо выделить популяцию экзосом из клеточного супернатанта и плазмы крови методами дифференциального ультрацентрифугирования и микрофильтрации. Однако также, можно воспользоваться технологией MACS® магнитной сепарации для выделения экзосом или внеклеточных везикул из клеточных супернатантов, плазмы крови или мочи. Выделение эксозом в данном случае осуществляется путем позитивной селекции с использованием наноразмерных магнитных частиц, конъюгированных с антителами, специфически распознающими тетраспанины CD9, CD63 и CD81, экспрессирующиеся на поверхности экзосом.

Образцы, которые содержат как минимум 500 нг белка (экзосом), в дальнейшем инкубируют со специфическими антителами (например, CD63-APC), также можно применить многоцветный цитометрический анализ. При этом, однако, необходимо убедиться, что при исследовании у вас проставлены все соответствующие контроли:

  1. Контроль буфера, для устранения шумов
  2. Контроль автофлюоресценции экзосом (неокрашенные экзосомы)
  3. Изотипические контроли, для определения и устранения сигнала неспецифического связывания антител.

На рисунке представлена стратегия гейтирования CD63+ экзосом с учетом контролей измерения.

С детальным протоколом исследования популяций экзосом и примерами стратегий гейтирования можно ознакомиться в брошюре «Характеристика популяций экзосом с помощью MACSQuant® Analyzer»

 

 

 

 

Быстрый скрининг поверхностных маркеров экзосом методом проточной цитометрии

Из-за слишком малого размера, экзосомы, до настоящего времени, было крайне сложно анализировать методами стандартной проточной цитометрии, что затрудняло научные исследования в данной области. Для того чтобы облегчить комплексный, многопараметрический анализ экзосом или внеклеточных везикул, компания Miltenyi Biotec разработала набор для комплексного скрининга поверхностных маркеров на экзосомах — MACSPlex Exosome Kit. Это уникальная мультиплексная платформа для скрининга белкового профиля экзосом методом проточной цитометрии, которая позволяет сэкономить драгоценный материал и провести исследование по 37 поверхностным маркерам одновременно.

Если у вас остались вопросы, пожалуйста, вы можете написать нам на info@biocommerce.ru